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    细胞凋亡检测试剂盒的原理、使用方法及注意事项
    点击次数:590 发布时间:2018-01-20

    细胞凋亡检测试剂盒的原理、使用方法及注意事项

    细胞凋亡与细胞坏死不同,细胞凋亡是为维持环境稳定,为更好的适应胜春环境而主动争取的一种死亡过程,它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等作用,是一种字体损伤的现象。zui常用的目前就是细胞凋亡检测试剂盒。

    细胞凋亡检测试剂盒原理

    细胞凋亡是细胞的基本特征之一,在机体的胚胎发育、组织修复、内环境的稳定等方面都起到十分重要的作用。Annexin V是一种分子量为35.8 KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白,能与细胞凋亡过程中翻转到膜外的磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine, PS)高亲和力特异结合。FITC-Annexin V结合到凋亡细胞后,在蓝色光的激发下,发出绿色荧光,区分出凋亡细胞与正常细胞。碘化丙啶(Propidium iodide,PI)是一种核酸染料,它不能穿透完整细胞膜,但对凋亡晚期细胞和死细胞的破损细胞膜能够穿透,并使细胞核红染。将FITC-Annexin V与PI匹配使用,可以将凋亡早期的细胞和晚期的细胞区分开来。

    细胞凋亡检测试剂盒使用步骤

    1. 调整待测细胞的浓度为5×105-1×106个/ml。 2. 取1ml细胞,1000rpm,4℃离心10分钟,弃上清。 3. 加入1ml预冷的PBS,轻轻震荡使细胞悬浮,1000rpm,4℃离心10分钟,弃上清(对于贴壁细胞,先用胰酶消化,再用PBS洗涤)。 4. 重复步骤3两次。 5. 将细胞重悬于200μl Binding Buffer。 6. 加入10μl Annexin V-FITC和10μl PI,轻轻混匀,避光室温反应15分钟 或4℃反应30 分钟。 7. 加入300μl Binding Buffer,在1小时内用流式细胞仪检测。 8. 若用荧光显微镜检测,将细胞混合液离心,取细胞沉淀涂片,再进行观察。

    使用细胞凋亡检测试剂盒的注意事项

    为保证得到理想的实验结果在使用此试剂盒之前请认真阅读该注意事项。

    1.旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心,将盖内壁上的液体甩至管底,避免开盖时液体洒落。

    2.Annexin V-FITC和Propidium iodide是光敏物质,在保存与操作时请注意避光。

    3.Propidium iodide(PI)能通过皮肤吸收,对眼睛有刺激作用。

    4.在细胞洗涤的zui后一步,请尽量将上清弃净,以免PBS残留影响实验结果。

     5.PI染色时间过长有可能造成检测的凋亡率偏高,建议首先进行Annexin V-FITC染色,上机前5分钟再加入PI染色。

    6.整个操作过程动作要尽量轻柔,勿用力吹打细胞,尽量在4℃下操作。

    7.反应完毕后请尽快检测,因为细胞凋亡是一个动态的过程,反应1小时后荧光强度就开始衰变。

    8.成功的检测凋亡受以下几种因素的影响,如细胞类型、细胞膜上PS的密度、发生凋亡时PS翻转的比例、诱导细胞凋亡的方法、所用试剂、诱导凋亡的时间等,把这些影响因素进行优化对实验成功是非常必要的。

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