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        对scFv基因文库及pHEN1噬菌体展示栽体的限制性消化
        点击次数:414 发布时间:2013-03-07

        [器材和试剂]
        ●NcoI和NotⅠ限制性酶以及厂商的缓冲液3(New England Biolabs)(NEB3缓冲液)
        ●100×乙酰化牛血清蛋白(BSA)(New England Biolabs,与NotⅠ一起提供)
        ●37℃孵育箱或者有加热盖的加热器
        ●GelleClean试剂盒(Qbiogene,Inc.)
        ●pHENl DNAL8),氯化铯纯化制备
        ●再扩增的scFv基因文库

        [方法]
        1,配制两个100ul PCR反应混合液来消化scFV文库,其中1个用于VH-VκscFv文库,另1个用于VH-Vλ scFv文库,该混合液含有:
        ●scFV DNA(1~4ug),50ul
        ●水,33ul
        ●10×NEB 3缓冲液,10ul
        ●乙酰BSA(100×),1.0ul
        ●Nco工(10U/ul),3.0f11
        ●NoJ工(10U/ul),3.0ul
        2.37℃孵育反应液过夜。要用37℃孵育箱或者有加热盖的加热装置,防止水分蒸发。或者,可以按PCR反应那样加一层矿物油(Sigma)。
        3.用1%琼脂糖胶纯化基因文库,并用Geneclean试剂盒提取DNA。重悬产物于30ul水中。在1%琼脂糖凝胶中,与已知大小和浓度的标准对照品比较,测定DNA浓度。
        4.消化4ug氯化铯纯化的pHENl DNA以准备载体,其过程完全如上述消化scFv基因文库的流程,但须将scFvDNA替换为质粒DNA②。
        5.用0.8%琼脂糖胶纯化已消化的载体DNA,再按处理scFv插入序列的方式,用Gene-clean自胶中提取载体片段。将产物重悬于30ul水中。在1%琼脂糖凝胶中,与已知大小和浓度的标准对照品比较,测定DNA浓度。

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